Hva er en polymerasekjedereaksjon (pcr)? fakta om test, trinn og brukt til

Hva er PCR (polymerasekjedereaksjon)?

Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en teknikk som brukes til å forsterke spormengder DNA (og i noen tilfeller RNA) lokalisert i eller på nesten hvilken som helst væske eller overflate der DNA-strenger kan bli avsatt. Nøkkelen til å forstå PCR er å vite at ethvert menneske, dyr, plante, parasitt, bakterie eller virus inneholder genetisk materiale som DNA (eller RNA) -sekvenser (nukleotidsekvenser eller deler av DNA eller RNA) som er unike for deres art, og til det enkelte medlem av den arten. Følgelig, hvis en prøve inneholder segmenter av DNA eller RNA, er PCR en metode som brukes til å amplifisere (lage mange flere identiske kopier) av disse unike sekvensene, slik at de deretter kan brukes til å bestemme med meget stor sannsynlighet kildens identitet (a spesifikk person, dyr eller sykdomsfremkallende organisme) av spor-DNA eller RNA funnet i eller på nesten hvilken som helst prøve av materiale.

PCR-forsterkning er imidlertid bare en del av den identifiserende testen. Når amplifiseringen er utført (se nedenfor), må de amplifiserte segmentene sammenlignes med andre nukleotidsegmenter fra en kjent kilde (for eksempel en spesifikk person, dyr eller patogen organisme). Denne sammenligningen av unike segmenter gjøres ofte ved å plassere PCR-genererte nukleotidsekvenser ved siden av kjente nukleotidsekvenser fra mennesker, patogener eller andre kilder i en separerende gel. Elektrisk strøm kjøres gjennom gelen og de forskjellige nukleotidsekvensene danner bånd som ligner en "stige" i henhold til deres elektriske ladning og molekylstørrelse. Dette kalles gelelektroforese. Bånd eller "stige" som trinn som vandrer til de samme nivåene i gelen, viser identiteten til nukleotidsekvenser. Denne metoden er en av de mest populære måtene PCR-tester er gjennomført (se fig 1).

Figur 1, bånd eller "stige" som trinn av PCR produsert DNA av Mycobacterium (høflighet av CDC)

Figur. Repetitive element (Rep) –PCR (A) og pulserende feltelektroforese (PFGE) (B) mønstre av Mycobacterium cosmeticum isolater fra 2 pasienter i Ohio og 1 pasient i Venezuela. Rep-PCR ble utført ved bruk av BOXA1R-primer (3), og PFGE ble utført med restriksjonsenzym AseI. Bane 1, 2, Ohio isolerer OH1 og OH2; bane 3, 4, kontrollstammer ATCC BAA-878T og ATCC BAA-879; bane 5, venezuelansk isolasjon VZ1. DNA-størrelsesstandarder er 100 bp (S1) og 48, 5 kb markør (S2).

Hvordan gjøres PCR (polymerasekjedereaksjon)?

I 1983 fant Kary Mullis ut de grunnleggende trinnene for å forsterke DNA-sekvenser. Han og Michael Smith ble tildelt Nobelprisen for å utvikle denne prosedyren i 1993. Det er noen få grunnleggende trinn som følges i rekkefølge; PCR kan gjøres i et enkelt rør med passende kjemikalier og en spesialdesignet varmeovn. Reagensene eller kjemikaliene som trengs er som følger:

• En prøve som inneholder en nukleotidsekvens (fra blod, hår, puss, skraping av huden, etc.)
• DNA-primere: kort enkeltstrenget DNA som festes til nukleotidsekvenser som fremmer syntesen av en komplementær nukleotidstreng
• DNA-polymerase: et enzym som når DNA har en grunning bundet, går nedover DNA-segmentet som fester DNA-byggesteiner for å danne komplementære basepar og dermed syntetiserer en komplementær nukleotidstreng av DNA (introduksjonen av en varmebestandig DNA-polymerase, Taq polymerase, avledet fra varmebestandige bakterier, forbedret markant evnen til å utføre PCR)
• Et stort overskudd av DNA-byggesteiner betegnet nukleotider (henholdsvis Adenine, Thymidine, Cytosine og Guanine, forkortet: A, T, C og G) er til stede i løsningen. Når disse blokkene er koblet sammen, danner de en nukleotidsekvens eller en enkelt DNA-streng. Når disse byggesteinene binder sin komplementære byggestein av svake hydrogenbindinger (for eksempel vil A bare binde seg til T og G bare med C), dannes en komplementær DNA-nukleotidsekvens og bindes til den opprinnelige, enkeltstrengede DNA. Når bindingen er fullført, dannes et komplementært dobbeltstrenget DNA i en spesifikk sekvens.

PCR begynner deretter med et segment av DNA fra en prøve som blir plassert i et rør med reagensene oppført ovenfor. Oppløsningen blir oppvarmet til minst 94 ° C; denne varmen bryter hydrogenbindingene som lar komplementære DNA-tråder dannes, så det finnes bare enkle tråder i blandingen (dette kalles denaturering av dobbeltstrenget DNA).

Blandingen får avkjøle seg til ca. 54 ° C. Ved denne temperaturen binder DNA-primerne og DNA-polymerase seg til individuell enkelstrenget DNA (dette kalles annealing av DNAet). Fordi byggesteinene er i overkant (høy konsentrasjon) i blandingen, bruker polymerasen dem til å lage nye komplementære DNA-tråder (betegnet utvidelse av DNA), og denne prosessen er raskere ved 72 ° C. Denne prosessen lager et nytt dobbeltstrenget DNA-molekyl fra hver av de enkle trådene til det opprinnelige molekylet.

Denne syklusen gjentas omtrent 40 ganger i en maskin som kalles en termisk syklator som automatisk gjentar varmekjølesyklusene, med mengden av hver DNA-sekvens som dobler seg hver gang varmekjølesyklusen er fullført. Det som opprinnelig var et eneste kort segment av DNA, kan forsterkes til rundt 100 milliarder eksemplarer etter 40 doblingssykluser.

Hvorfor vil en lege bestille en PCR-test (polymerasekjedereaksjon)?

PCR-testen danner grunnlaget for en rekke tester som kan svare på mange forskjellige medisinske spørsmål som hjelper leger med å diagnostisere og behandle pasienter. For eksempel kan PCR-tester påvise og identifisere sykdomsfremkallende organismer hos pasienter, spesielt de som er vanskelige å dyrke (for eksempel HIV og andre virus og visse sopp).

Andre leger bestiller PCR-tester for å diagnostisere genetiske sykdommer, mens andre leger bruker PCR for å oppdage biologiske sammenhenger som å identifisere foreldre til barn. PCR-tester brukes også til å identifisere og karakterisere genetiske mutasjoner og omorganiseringer som finnes i visse kreftformer.

Imidlertid har PCR-tester blitt modifisert og utvidet til mange aspekter ved vitenskapelige undersøkelser, inkludert evolusjonsbiologi, genetisk fingeravtrykk, rettsmedisinske undersøkelser og mange andre.

Hva er RT-PCR?

RT-PCR er en PCR-test som er designet for å oppdage og måle RNA. Selv om innledende PCR-tester amplifiserte DNA, bruker mange virus og andre biologiske komponenter (for eksempel mitokondrier) RNA som genetisk materiale. RT-PCR skiller seg fra konvensjonell PCR ved først å ta RNA og konvertere RNA-strengen til en DNA-streng. Dette gjøres ved i det vesentlige den samme metoden for PCR beskrevet ovenfor, med unntak av å bruke et enzym kalt revers transkriptase i stedet for DNA-polymerasen. Den omvendte transkriptasen tillater en enkelt RNA-streng å bli oversatt til en komplementær DNA-streng. Når denne reaksjonen inntreffer, kan den rutinemessige PCR-metoden deretter brukes til å amplifisere DNA. RT-PCR har blitt brukt til å oppdage og studere mange RNA-virus.

RT-PCR skal ikke forveksles med en annen variant av PCR, kalt Real-Time PCR. Real-Time PCR er en variant av PCR som tillater analyse av amplifisert DNA i løpet av de vanlige 40 syklusene av prosedyren. Selv om prosedyren er lik konvensjonell PCR ved sykling, bruker Real-Time PCR fluorescerende fargestoffer festet til noen av byggesteinene eller små nukleotidstrenger. Avhengig av metoden som brukes, oppstår fluorescens når de amplifiserte DNA-strengene dannes. Mengden fluorescens kan måles gjennom de 40 syklusene og lar etterforskerne måle spesifikke produkter og mengder av dem under amplifiseringssyklusene. Dette lar ofte etterforskere eller laboratorieteknikere hoppe over gelelektroforese eller andre sekundære prosedyrer som er nødvendige for analyse av PCR-produktene, og dermed gi raskere resultater.

Real-Time PCR og RT-PCR er varianter eller modifikasjoner av den originale PCR-testen. Imidlertid er det mange flere varianter (minst 25) som finnes og brukes til å løse spesifikke problemer. De har alle forskjellige navn som Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-phase PCR og mange andre.

PCR vil sannsynligvis fortsette å bli modifisert for å hjelpe med å svare på andre spørsmål innen medisin, biologi. og andre studieretninger.